Sekuensing DNA
adalah suatu metode untuk mengetahui urutan basa nitrogen dalam suatu rangkaian
DNA. Dengan metode tersebut, para peneliti, saat ini telah mengetahui
(melakukan sekuensing) urutan basa nitrogen pada keseluruhan genom manusia dan
berbagai spesies lain.
Awalnya, sekuensing
DNA genom manusia membutuhkan biaya sekitar 1 juta dollar. Namun dengan
perkembangan inovasi dan teknologi, semakin tahun biaya yang dibutuhkan untuk
sekuensing DNA semakin murah dan cepat. Bahkan untuk sekuensing keseluruhan
genom manusia saat ini hanya membutuhkan biaya sekitar 900 dollar dalam waktu 6
jam.
Sekuensing DNA menggunakan metode Sanger
Sekuensing DNA secara
otomatis pertama kali dilakukan oleh seorang ahli biokimia yang bernama Frederick
Sanger dengan teknik dideoxyribonucleotide
(or dideoxy) chain termination sequencing atau sering kali
disebut dengan teknik / metode Sanger.
Berkat metode / teknik tersebut Frederick Sanger berhasil
memenangkan penghargaan Nobel pada tahun 1980.
Prinsip dari Sekuensing
DNA dengan metode Sanger adalah sebagai berikut :
1. Fragmen DNA dengan panjang sekitar 800 – 1000 pasang basa
didenaturasi, dicampur dengan primer, DNA polimerasi, 4 macam dNTPs (deoxyribonucleotide)
yaitu deoxyadenosine
triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate
(dTTP), deoxyguanosine
triphosphate (dGTP) dan deoxycytidine triphosphate
(dCTP) dan 4 macam ddNTPs (dideoxyribonucleotide).
ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
yang digunakan dalam metode Sanger tersebut
telah dilabeli dengan fluorescent.
Perbedaan antara
dNTPs (deoxyribonucleotide)
dan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
terletak gugus kimia yang menempel pada ujung 3’. dNTPs (deoxyribonucleotide)
mempunyai gugus –OH pada ujung 3’ sedangkan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
tidak mempunyai gugus –OH pada ujung 3’.
2. Jika primer mereplikasi DNA dengan menambahkan dNTPs (deoxyribonucleotide)
maka proses replikasi DNA tersebut akan terus berjalan karena gugus –OH pada
ujung tiga bisa ditempeli oleh dNTPs atau ddNTPs. Namun jika primer mereplikasi
DNA dengan menambahkan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
proses replikasi DNA tersebut akan terhenti karena ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
tidak dapat ditempeli dNTPs atau ddNTPs baru pada ujung 3’ nya (ujung 3’ tidak
mempunyai gugus -OH).
3. Dengan adanya dNTPs (deoxyribonucleotide)
dan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
maka dalam campuran tersebut akan terbentuk fragmen- fragmen DNA hasil
replikasi dengan ukuran yang berbeda-beda sebanyak jumlah basa nitrogen dari
template DNA yang digunakan. Campuran tersebut kemudian dilewatkan pada suatu
pipa kapiler yang dapat memisahkan fragmen –fragmen DNA dalam larutan
berdasarkan beratnya (panjang fragmen). Fragmen – fragmen DNA yang telah
terpisah-pisah tersebut kemudian dideteksi secara berurutan mengunakan fluorescence
detector sehingga dihasilkan urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
yang menempel pada tiap-tiap ujung fragmen. Urutan ddNTPs (dideoxyribonucleotide)
tersebut merupakan urutan basa komplementer dari DNA template.
 |
| Gambar 1. Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger |
Sekuensing DNA menggunakan metode Next-Generation Sequencing
Para
peneliti terus mengembangkan teknik sekuensing DNA. Untuk sekuensing DNA dalam
jumlah besar misalkan sekuensing genom manusia, metode Sanger mulai
ditinggal. Para peneliti mulai menggunakan metode atau teknik yang sering kali
disebut dengan “next-generation sequencing”.
Prinsip kerja sekuensing
DNA dengan teknik / metode next-generation sequencing
adalah sebagai berikut :
1. Genom DNA yang akan
disekuensing terlebih dahulu harus dipotong potong dengan ukuran 400 sampai 100
pasang basa per potongan (fragmen).
2. Tiap – tiap fragmen
DNA diisolasi dalam larutan yang berisi manik (bead).
3. Fragmen DNA tersebut
kemudian diperbanyak dengan teknik Polimerase Chain Reaction
(PCR). Manik (bead) yang ada dalam larutan tersebut mampu mengikat single strand
DNA hasil perbanyakan DNA dengan Polimerase Chain Reaction
(PCR) pada ujung 5’ sehingga seluruh copi DNA hasil Polimerase Chain
Reaction (PCR) terikat pada manik (bead).
4. Manik (bead) yang
telah mengikat single
strand DNA kemudian dimasukkan ke dalam salah salah satu sumuran
(well). Sumuran (well) tersebut berisi primer dan DNA polimerase sehingga dapat
menghibridisasi single
strand DNA yang menempel pada manik (bead).
5. Pada alat tersebut
terdapat 2 juta sumuran yang masing – masing diisi fragmen – fragmen DNA genom
yang akan disekuensing.
Sumuran ynag telah
terisi single
strand DNA, primer dan DNA polimerase kemudian ditambahkan
dengan 4 jenis dNTPs (deoxyribonucleotide)
yaitu deoxyadenosine
triphosphate (dATP), deoxythymidine triphosphate
(dTTP), deoxyguanosine
triphosphate (dGTP) dan deoxycytidine triphosphate
(dCTP) secara bergantian. Tiap – tiap akan dilakukan pergantian jenis dNTPs (deoxyribonucleotide)
sumuran dicuci terlebih dahulu agar tidak terkontaminasi dNTPs (deoxyribonucleotide)
yang ada sebelumnya.
Baca Juga : Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
Baca Juga : Tahapan Polymerase Chain Reaction (PCR)
6. Jika dNTPs (deoxyribonucleotide)
yang ditambahkan dalam sumuran komplemanter dengan basa nitrogen dari single strand
DNA, Misalnya basa nitrogen dari single strand
DNA yang belum berpasangan dengan dNTPs (deoxyribonucleotide)
adalah Timin (T) sedangkan dNTPs (deoxyribonucleotide)
yang ditambahkan dalam sumuran adalah dTTP, maka
keduanya akan berpasangan dan melepaskan PPi. PPi tersebut akan menghasilkan
cahaya yang kemudian direkam oleh mesin.
7. Sumuran
kemudian dicuci dan ditambah dNTPs (deoxyribonucleotide)
lain, Jika dNTPs (deoxyribonucleotide)
yang ditambahkan dalam sumuran tidak komplemanter dengan basa nitrogen dari single strand
DNA,misalnya basa nitrogen dari single strand
DNA yang belum berpasangan dengan dNTPs (deoxyribonucleotide)
adalah Guanin (G) sedangkan dNTPs (deoxyribonucleotide)
yang ditambahkan dalam sumuran adalah dTTP, maka keduanya tidak berikatan dan tidak menghasilkan PPi.
8.
Proses tersebut diulang-ulang hingga seluruh basa nitrogen dari single strand
DNA berpasangan dengan komplementernya. Ada tidaknya cahaya PPi tersebut lah yang akan di rekam dan diolah sehingga
didapatkan data urutan basa nitrogen dari fragmen single strand
DNA.
 |
| Gambar 2. Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing |
Sekuensing DNA menggunakan metode sekunsing generasi ketiga (third generation sequencing)
Para
peneliti terus mengembangkan berbagai teknik / metode sekuensing DNA yang lebih
cepat, murah dan effisien yang dikenal dengan metode sekuensing DNA
generasi ke tiga. Dengan metode ini, DNA genom yang akan disekuensing
tidak perlu dipotong – potong. Ikatan ganda pada DNA genom tersebut diputus.
Single stranded DNA kemudian dilewatkan pada pori kecil (berukuran nano) yang
tertanam pada suatu protein membran. Pori kecil tersebut protein serupa dengan protein
integral yang terdapat pada membran fosfolipid bilayer. Basa nitrogen (nukleotida)
yang masuk ke dalam pori tersebut akan menimbulkan suatu arus. Arus yang dihasilkan
oleh suatu nukleotida berbeda-beda sehingga perbedaan tersebut dapat
dimanfaatkan untuk mengetahui sekuen DNA yang sedang melewati pori.
 |
| Gambar 3. Konsep sekuensing DNA generasi ke tiga |
Demikian postingan kali ini tentang Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3 Semoga bermanfaat
Kata Kunci Pencarian :
Tahapan Sekuensing DNA menggunakan metode next-generation sequencing, Tahapan sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger, sekuensing adalah, sequensing adalah, sekuensing DNA generasi ke tiga, Sekuensing DNA menggunakan Metode Sanger dan Metode Next-Generation Sequencing, Metode Sekunsing DNA generasi ke 3
0 komentar